PRACTICA: 7
Objetivo:
Determinar cuantos gr de hemoglobina (Hb) hay en toda la sangre circulante, para tener un diagnostico clínico ya que se pueden variar diversas enfermedades debido a un valor anormal de Hemoglobina.
Fundamento:
La hemoglobina es una proteína conjugada que sirve para el transporte de oxígeno y dióxido de carbono. La masa total de eritrocitos de un adulto contiene unos 600gr. De hemoglobina capaces de transportar 800ml de oxígeno.
Una molécula de hemoglobina consta de 2 pares de cadenas polipepticas (unión de aminoácidos) (globina) y 4 grupos proteicos HEM que contienen cada uno un átomo de fe en estado ferroso. Cada punto HEM se localiza en una zona determinada de una de las cadenas de polipepticos. Localizando cerca la superficie de la molécula, el HEM se combina de forma reversible con una molécula de oxigeno y dióxido de carbono. Este grupo HEM es el responsable del del color rojo de la hemoglobina (hb).
La parte proteica o globina tiene 4 cadenas polipeptidicas que se denominan con las letras α, β, γ, δ. Existe una cadena mas la ε que esta presente durante los 3 primeros meses de vida se diferencian unas de las otras en el numero o posición (de los aminoácidos de los que están compuestas). Por lo tanto existen varios tipos de hb. en el ser humano se pueden encontrar las siguientes hemoglobinas normales:
Hemoglobina A: consat de 2 cadenas α y 2 cadenas β en un adulto normal corresponde a mas del 95% del total.
Hemoglobina A´: consat de 2 cadenas α y 2 cadenas δ en un adulto sano esta en porción menor de 3%.
Hemoglobina F (fetal): consa de 2 cadenas α y 2 cadenas γ. Es la hemoglobina principal en el feto desde el 4° mes del embarazo hasta aproximadamente los 6 meses de edad. La Hb F tiene mayor afinaidad por el oxigeno.
Hemoglobina Gower: consa de 2 cadenas α y 2 cadenas ε. Desaparece casi por completo en el tercer mes de embarazo y empieza a aparecer la Hb fetal.
Algunos datos se obtiene exmainando a simple vista una muestra de sangre. Un aspecto normal del suero o del plasma revela que el pigmento esta en los glóbulos rojos. Si se agita en una sangre total normal en el aire durante 15 min. Adquere un color rojo claro por convertir la Hb en oxihemoglobina.
La sangre tiene un color rojo cereza brillante cuando el pigmento es carboxi-hemoglobina en la intoxicación por CO. El color es chocolate en la metahemoglobulemia y la banda malvada en alsulfohemoglobulemia.
Las distintas Hb tienen espectros de absorción características a las que determina en un espectofotometro. La identificación de difrenetes formas de la Hbcon la determinación de sus espectros de absorción puede hacerse de una manera sencilla
Material y Equipo:
· Un colorímetro fotoeléctrico o un espectrofotómetro.
· Una pipeta de vidrio graduada de 5 mL
· Pipeta semiautomática
· Tubos de ensayo.
· Cubetas cuadradas.
· Gradilla
· gasa
Reactivos:
· EDTA
· Reactivo Drabkin
· Ferrocianuro de potasio
· Cianuro de potasio
· Bicarbonato de potasio
· Solución estándar de cianometahemoglobina
Reactivos biológicos:
· Sangre venosa con EDTA.
1.-En un tubo de 13 x 100 colocar exactamente 5 mL de reactivo de Drabkin, marcarlo como problema (P).
2.-Obtener 5 ml de sangre venosa con anticoagulante (EDTA).
3.- Mezclar perfectamente la sangre problema, por inversión por lo menos 20 veces antes de tomar la muestra.
4.-Con una pipeta automática o pipeta de Shali se toma exactamente 0,02 mL (20 µL) de sangre total, limpiar luego la punta de la pipeta.
5.-La sangre tomada del tubo con EDTA se vierte en el tubo que contenga reactivo de Drabkin. Se enjuaga 3 veces y se mezcla.
6.- Mezcle la solución de Drabkin con la sangre por inversión y con mucha precaución (utiliza parafilm para tapar los tubos, recuerda que el reactivo tiene cianuro, el cual es un VENENO).
7.-Dejar en reposo por espacio de 3 a 5 minutos. Para que se efectúe la reacción.
8.-Después de ese tiempo se observara una coloración roja transparente, se llena las cubetas hasta la marca que se encuentra y se procede la lectura.
9.-Leer en absorbancia con filtro verde a 540 nm llevando a cero el fotómetro con agua destilada / Drabkin.
Antes de hacer la medición con el espectrofotómetro hacer el siguiente procedimiento
PARA HACER LA MEDICION DE TRANSMITANCIA HACER EL SIGUIENTE PROCEDIMIENTO:
Medición de Transmitancia:
1.- Encender el Espectrofotómetro 30 minutos antes, después seleccione la longitud de onda deseada (540 nm para Hb) con las teclas numéricas y oprima <GO TO>. Aparecerá en la pantalla el valor numérico.
2.-Presine < %T> para Transmitancia.
Aparecerá en la pantalla “T”.
3.-Insertemla cubeta con el blanco en el portacubeta, cierre la puerta y oprima <SECOND FUNCTION> Y <100 %>. Aparecerá En la pantalla 100.0 T.
4.-Remueva el blanco e inserte la muestra problema contenida en la celda y cierre la puerta.
Aparecerá en la pantalla el valor en Transmitancia.
5.-Si desea imprimir, oprima <PRINT> para avance de papel y/o una segunda vez para la impresión en el papel del espectrofotómetro o <SECND REMOTE> para mandar a un dispositivo externo (a la computadora).
6.-Retire la cubeta del compartimiento y cierre la puerta (lave la cubeta y guárdela).
7.- para entender lo hablado ver la imagen siguiente:
8.-Si no va usar más el aparato, apáguelo y cúbralo, si desea continuar trabajando, elija el modo de trabajo siguiente y continúe.
Este fue el resultado que nos salió en el espectrofotómetro.
Cálculos:
.461/.472 x 15 = 14.65
Rango:
normal ya que era la muestra de una mujer
Cálculos:
Hb total = concentración
de Hb (gr/ml) x volumen sanguíneo (ml).
en espectofotometro se aplica la siguiente formula:
muestra/ estandar x 15 = Hb
en espectofotometro se aplica la siguiente formula:
muestra/ estandar x 15 = Hb
Valores de referencia:
Niños al nacer…………………………….. 13,6 - 19,6 g/dL
Niños de 1 año…………………………..... 11,3 - 13,0 g/dL
Niños de 10 -12 años……………………... 11,5 - 14,8 g/dL
Mujeres……………………………………... 11,5 - 16,5 g/dL
Hombres……………………………………. 14,0 - 18,0 g/dL
Observaciones:
Al hacer la práctica notamos que para determinar este volumen que existe de Hb circulante en la sangre es fácil y sencillo de sacar ya que a la hora de meterlo al espectrofotómetro prácticamente nos dice todo solo hay que sacar el resultado haciendo la operación básica que ya nombramos anteriormente.
Conclusiones:
En esta practica hay que tener mucho cuidado en como se realiza el procedimiento, pues si ponemos de más en la cuba de muestra se altera el resultado o si calibramamos mal el espectrofotometro, debido a que la primera vez no fue bien realizada esta practica tuvimos que realizarla 2 veces.
Referencias:
· Hematología: fundamentos y aplicaciones clínicas
Escrito por Bernadette F. Rodak
Pag. 171.
·
Laboratorio de diagnóstico clínico
Escrito por Díaz Martín, Gustavo
A.
Pag. 395-396
